Manlio Di Stefano est né à Palerme, en Sicile, en 1981.
Après avoir obtenu son diplôme en génie informatique, il a travaillé comme consultant informatique pour une entreprise américaine. Parallèlement, il a agi comme volontaire pour une ONG italienne opérant en République démocratique du Congo et au Guatemala sur des projets liés au développement durable. En 2013, il est devenu membre du Parlement italien et il a ensuite été choisi par ses collègues comme chef de groupe du Mouvement cinq étoiles au sein de la commission des affaires étrangères pour l’ensemble de la législature.
Depuis 2013, il est membre de la délégation italienne auprès du Conseil de l’Europe où il est président du Comité sur les enfants et les jeunes réfugiés et migrants et il a conclu et présenté avec succès deux rapports sur l’apatridie des enfants et les mineurs migrants non accompagnés. Depuis 2014, il est le superviseur national de LEX Parlamento, l’un des principaux outils inclus dans la plate-forme Web du Mouvement Cinq Étoiles pour la démocratie électronique, appelée Rousseau.
En mars 2018, il a été réélu membre du Parlement italien et quelques mois plus tard, le 13 juin, il a été nommé vice-ministre des affaires étrangères par le gouvernement du Premier ministre Conte.
